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磷酸化蛋白檢測試劑盒采用酶標(biāo)儀法的具體步驟
發(fā)布日期：
2017-10-14
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磷酸化蛋白檢測試劑盒首先用熱堿將磷酸化蛋白中的磷酸基團水解下來，再通過染料分子與游離的磷酸分子結(jié)合，形成染料-磷酸復(fù)合物。本試劑盒具有操作簡單快速、定量范圍大、線性好和實驗方案靈活等特點。
1.選取18個酶標(biāo)孔，分為標(biāo)準(zhǔn)組和樣品組，依次分別標(biāo)號1-7,8-9，均設(shè)置重復(fù)管號。樣品實驗前可做適當(dāng)稀釋或濃縮，樣品可取2個不同濃度梯度。標(biāo)號為8-9。標(biāo)準(zhǔn)組各管分別加入50 μl各濃度的磷酸化標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液；樣品組分別加入50μl磷酸化蛋白樣品。
2.各管加入50 μl 2.0 mol/L NaOH，混勻。 65℃水浴，保溫30 min。
3.待溶液冷卻至室溫后，各管加入50 μl 4.7 mol/L HCl，混勻。
4.各管加入50 μl檢測液，混勻。室溫靜置30 min，期間混勻1-2次，進行吸光度值檢測前再混勻1次。
5.以0號管作為空白對照，在分光光度計上測各管的A620值。
6.以標(biāo)準(zhǔn)組各管A620平均值為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的磷酸化標(biāo)準(zhǔn)蛋白終濃度為橫坐標(biāo)，在酶標(biāo)儀上或Microsoft Excel軟件中繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由樣品管各管A620平均值計算樣品中磷酸化蛋白的濃度。
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