使用方法

 

　　1.融化蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，取適量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至終濃度為0.5mg/mL。蛋白樣品使用什么溶液溶解，標(biāo)準(zhǔn)品也應(yīng)用什么溶液稀釋，但是為了簡(jiǎn)便起見，也可以用0.9%NaCl或PBS稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。將標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足到20μL，相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL。

 

　　2.根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B(50:1)配制適量BCA工作液，充分混勻。例如5mLBCA試劑A加100μLBCA試劑B，混勻，配制成5.1mlBCA工作液。BCA工作液室溫24h內(nèi)穩(wěn)定。

 

　　3.加適當(dāng)體積樣品到96孔板的樣品孔中，也加稀釋液到20μL。

 

　　4.各孔加入200μLBCA工作液，37℃放置20~30min。也可以室溫放置2h，或60℃放置30min。

 

　　5.測(cè)定A562吸光值，540~595nm之間的波長也可接受。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的蛋白濃度。

 

　　注意事項(xiàng)

 

　　1.蛋白標(biāo)準(zhǔn)品配制后可立即使用，也可以-20℃長期保存。

 

　　2.BCA法測(cè)定蛋白濃度時(shí)，顏色會(huì)隨著時(shí)間的延長不斷加深。并且顯色反應(yīng)會(huì)因溫度升高而加快。如果濃度較低，適合在較高溫度孵育或適當(dāng)延長孵育時(shí)間以獲得更好檢測(cè)效果。

 

　　3.因?yàn)檠娱L孵育時(shí)間會(huì)引起吸光值的變化，所以在用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)時(shí)，應(yīng)盡可能加快檢測(cè)速度，以免先檢后檢產(chǎn)生系統(tǒng)誤差。

 

　　4.標(biāo)準(zhǔn)蛋白液的加量應(yīng)當(dāng)準(zhǔn)確，如果加量不準(zhǔn)確，會(huì)導(dǎo)致制作出來的標(biāo)準(zhǔn)曲線出現(xiàn)偏差，影響待測(cè)樣品的濃度計(jì)算，所以一方面需要用梯度稀釋的方法來配置標(biāo)準(zhǔn)蛋白液，另一方面應(yīng)使用精確度高的移液槍。